反硝化基因工程菌株YP4S的构建及对污水除氮特性研究

从养殖场污泥中筛选出菌株YP4,经16S rDNA分子发育树的同源序列比对,确定为克雷伯什菌属(Klebsiella sp.)。由NCBI数据库查编码亚硝酸还原酶(Nir)的基因nirS序列,设计引物,以铜绿假单胞菌PAOI基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增目的片段nirS,经过双酶切、克隆和转化,得到重组质粒pYP4S,然后转化野生菌株YP4,构建反硝化基因工程菌YP4S。菌株生长曲线测定表明,工程菌株YP4S与YP4的生长特性基本一致。工程菌株YP4S对模拟污水COD、TN、NH_4^+-N和NO_3^--N具有较高的去除率,YP4S与YP4相比,对NO_2^--N积累的减少量为(32.44±3.96)%,明显减少了NO_2^--N的积累。通过正交试验获得工程菌株YP4S在C/N=10、T=30℃、r=200 r/min和pH=7.0的最佳组合条件下,对模拟污水TN去除率较高。应用工程菌株YP4S处理猪场沉淀池的实际污水,COD、TN、TP、NH_4^+-N和NO_3^--N去除率分别为(95.87±0.82)%、(76.38±3.84)%、(97.13±0.54)%和(75.35±2.57)%,NO_2^--N积累量为(3.31±1.24) mg/L,表明工程菌株YP4S具有较好反硝化作用,对含氮量高的实际污水修复具有潜在的应用前景。     

尿黑酸双加氧酶基因工程菌的构建

为了构建不同表达类型的尿黑酸双加氧酶(Dio6)基因工程菌,本研究利用Over-lap PCR技术使双加氧酶基因在组成型启动子(P2和P_(spoⅠ-Ⅱ))的控制下表达;利用高效液相色谱(HPLC)技术测定XJ-6、XJ-6+P_(T7)、XJ-6+P2、XJ-6+P_(spoⅠ-Ⅱ)、P_(spoⅠ-Ⅱ)、P2、P_(T7)在7 d对芘的降解。研究结果表明:构建得到3种启动子控制表达的基因工程菌,协同效应研究表明工程菌在XJ-6的协助下可以在含芘的无机盐培养基中生长,并且组成型启动子工程菌的菌数远高于诱导型启动子工程菌的菌数。组成型启动子相较于诱导型启动子工程菌能更稳定表达外源双加氧酶基因,由于诱导型启动子工程菌需要诱导剂IPTG,并且表达双加氧酶基因会受到诱导剂浓度、诱导温度等条件的影响,所以在实际应用中组成型启动子工程菌优于诱导型启动子工程菌。     

武夷菌素高产基因工程菌株Streptomyces albulus OoWysR活性成分的分离鉴定

【背景】武夷菌素高产基因工程菌株Streptomyce albulus OoWysR具有明显的抑菌效果。【目的】明确S.albulus OoWysR的活性成分。【方法】采用柱层析法,利用大孔吸附树脂、离子交换树脂和高效液相色谱等对S.albulus OoWysR的活性成分进行分离纯化,经高分辨率电喷雾电离质谱(high-resolution electrospray ionization mass spectrometry,HR-ESI-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等波谱技术对化合物化学结构进行鉴定,并通过生长速率法测定化合物的生物活性。【结果】从S.albulus OoWysR中分离鉴定出4个化合物,分别为对羟基苯甲酸(1)、吡咯-2-羧酸(2)、对羟基苯乙醇(3)和云南霉素(4)。化合物1对玉米弯孢病菌、番茄叶霉病菌、玉米小斑病菌和烟草赤星病菌具有一定的抑制作用;化合物2对番茄灰霉病菌、大豆菌核病菌、苹果腐烂病菌、玉米小斑病菌、小麦赤霉病菌、稻瘟病菌和烟草赤星病菌具有一定的抑制作用;化合物3对番茄灰霉病菌、苹果轮纹病菌、玉米小斑病...     

提高肺炎克雷伯氏菌产1,3-丙二醇的分子生物学方法研究进展

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)可用于工业合成多种化合物,包括聚酯、聚醚和聚氨酯。发酵法生产1,3-PD具有巨大潜力。本文从代谢途径分析入手,梳理了肺炎克雷伯氏菌厌氧代谢途径的相关酶及催化作用,较详细地综述了其产1,3-PD关键酶的分子改造、基因工程菌株的构建和关键酶基因表达、副产物相关代谢酶基因敲除等方面的最新进展,并展望了其今后的发展前景。     

无绿藻分子生物学鉴定与分型研究新进展

以基因序列为鉴定基础的分子生物学方法以其客观、可重复性好等优点,被认为是分子鉴定无绿藻的"金标准"。该文对近年来应用在无绿藻鉴定和分型方面的实时定量PCR(Real-Time Quantitative PCR,RT-PCR)技术、单链构象多态性(Single Stranded Conformation Polymophism,SSCP)分析、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分析、高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析、质谱(Mass Spectrometry,MS)分析等分子生物学新技术和新方法进行综述。     

基因重组TNFα衍生物TRSP10的高效制备及其对DU145细胞抑制作用研究

利用基因工程技术表达能够促使肿瘤细胞DU145凋亡的肿瘤坏死因子α(TNFα)的衍生物TRSP10,并在体外研究其对DU145细胞的抑制效应。以重叠延伸PCR方法合成TRSP10基因序列,并插入高效表达的质粒载体p KYB-MCS的NdeⅠ和SapⅠ酶切位点之间,优化融合蛋白诱导表达的条件,建立了从载体构建到重组菌表达、制备的工艺技术条件。MTT法检测TRSP10对前列腺癌细胞DU145增殖的抑制作用。实验结果表明:重组菌ER2566诱导表达可溶性融合蛋白的最佳条件是诱导剂IPTG浓度为0.8 mmol/L、诱导表达温度37℃、诱导表达时间8h。利用IMPACT系统及HPLC技术纯化制备TRSP10,得到产物纯度达到96%,质谱鉴定确定其分子质量为3.59k Da,与理论值相符;体外细胞学研究结果表明,TRSP10对前列腺癌细胞DU145有明显的抑制作用,在5,10,20,40μmol/L TRSP10及10μmol/L TNFα阳性对照处理后48h抑制率分别达到11.40%,22.97%,33.26%,48.35%及42.50%。     

合成生物学技术在糖胺聚糖生产中的应用

糖胺聚糖是一类直链酸性多糖,具有优良的生物相容性和生理活性,被广泛应用于临床治疗,并用作药物运输载体,其中透明质酸、 肝素和硫酸软骨素的相关研究最为深入。由于传统方式（如动物组织提取法等）制备糖胺聚糖,存在外毒素、病毒等致病因子污染的风 险,因而,利用合成生物学技术,构建重组工程菌株生产糖胺聚糖,逐渐受到研究者们的重视。主要围绕透明质酸、肝素前体及软骨素, 综述糖胺聚糖的生物合成途径,并探讨产糖胺聚糖基因工程菌的构建以及糖胺聚糖生物合成过程中分子质量调控机制,以期为构建产高 品质糖胺聚糖工程菌株提供新思路。     

淡水超微型浮游植物多样性及其研究方法

超微藻广泛分布于海洋和淡水生态系统中,在水生生态系统尤其是微食物环中起着重要作用。自20世纪70年代被发现以来,有关超微藻的研究大多集中在海洋,直到近年来淡水超微藻才受到广泛关注。目前淡水生境中发现的超微藻主要包括真核超微藻和原核聚球藻,而在海洋生境中分布广泛的原绿球藻在淡水环境中则很少被发现。超微真核藻多样性极其复杂,几乎在所有的门类都有发现;而目前在中国湖泊中发现的聚球藻主要以富含藻蓝素的聚球藻为主。影响超微藻生长的因子主要包括营养盐、温度、光照及生物因子(如捕食)等,自然水体的超微藻可能同时受多个以上环境因子的共同影响。由于超微藻细胞微小,形态特征不明显,而且大部分物种不能被分离纯培养,因此传统研究方法受到限制,直至近些年来,荧光显微技术、流式细胞术及分子生物学技术的发展,才使我们有机会对超微藻多样性和生态学有了进一步的认识。本文对淡水超微藻多样性的研究进展进行了综述,介绍了淡水超微藻的主要类群及其环境影响因子,重点阐述了当前超微藻的研究方法。     

表面展示表达植酸酶的重组酿酒酵母构建及酒精发酵

以淀粉为原料的同步糖化发酵是目前乙醇生产的主要途径之一。然而原料中含有的植酸不仅影响酒精发酵效率,而且也会导致环境中难以被植物吸收的磷含量的增加,加剧环境污染。将来源于大肠杆菌的植酸酶基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列连接并置于α-因子分泌信号肽下游,构建植酸酶表面展示表达重组载体pMGK-AG-phy并转化工业酿酒酵母,成功获得了在细胞表面锚定表达植酸酶的重组菌PHY。重组酵母的植酸酶表达水平达到6.4 U/g(菌体湿重),其最适温度为55℃,最适pH 4.0,在pH 3.5–4.5范围内具有较高的活性。以玉米粉为原料的同步糖化发酵实验表明,重组酵母PHY的生长速度高于出发菌株,同时酒精产量相较于出发菌株提高了3.7%。更为重要的是发酵后酒糟中植酸磷含量与对照相比降低了91%。构建的表面展示表达植酸酶的重组工业酿酒酵母能够有效降低植酸含量,提高了酒糟的利用价值,减少磷排放,对燃料酒精的环境友好生产具有重要的借鉴意义。     

精雕思维,提升素养——高中教材中“基因工程”复习方法的思考

复习基因工程的内容时,抓住怎样培育抗虫棉这一核心进行多方位多角度的联想,将联想到的内容编写成相应的问题,从而在引出、深入、延伸核心问题等层面上展开复习,以求达到精雕思维,提升素养的目的。